蛤弧菌探針法定量PCR熒光檢測試劑盒

注意事項：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

儲存條件：

14℃或－20℃樣品收集、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉(zhuǎn)離心30 分鐘取上清。
3. 細(xì)胞上清液：3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

探針法：
蛤弧菌探針法熒光定量PCR檢測試劑盒aqMan 探針是一種寡核苷酸探針，它的熒光與目的序列的擴(kuò)增相關(guān)。它與目標(biāo)序列上游引物和下游引物之間的序列配對。熒光基團(tuán)連接在探針的5’ 末端，而淬滅劑則在3’ 末端。當(dāng)完整的探針與目標(biāo)序列配對時，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與3’ 端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進(jìn)行延伸反應(yīng)時，聚合酶的5’ 外切酶活性將探針進(jìn)行酶切，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分離。隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來的熒光基團(tuán)不斷積累。因此熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量呈正比關(guān)系。相對于染料法,Taqman探針法具有更高的特異性和準(zhǔn)確性。
使用方法：
一、樣品DNA的制備
用自選方法提取細(xì)菌樣品DNA。注意：DNA純化方法是決定檢測靈敏度的關(guān)鍵因素。如果不能很好純化樣品DNA，后面的PCR再靈敏也不能提高整體檢測靈敏度。
二、制備O157:H7標(biāo)準(zhǔn)曲線（以10-10E6這6個10倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體病毒做陽性對照，只提供沒有傳染性的、可以直接使用的DN段作為陽性對照。
1. 標(biāo)記6個離心管，分別為6，5，4，3，2和1號。
2. 用帶芯槍頭分別加入45 μL超純水（用帶芯槍頭，下同）。
3. 先將本試劑盒提供的陽性對照用TE緩沖液或超純水10倍梯度稀釋到10E7拷貝/μL（注：請不要將本試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品一次性稀釋至10E7拷貝/μL，建議每次稀釋10倍，梯度稀釋至10E7拷貝/μL）。
4. 在6號管中加入5 μL 10E7拷貝/μL的O157:H7陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得10E6拷貝/μL的陽性對照。
5. 換槍頭，從6號管中取5 μL溶液到5號管中，充分震蕩1分鐘，得10E5拷貝/μL的陽性對照。
6. 換槍頭，從5號管中取5 μL溶液到4號管中，重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。
7. NC管中不加任何陽性對照。
8. 從1-6號管中分別取5 μL和待測樣品一起進(jìn)行定量PCR（見下步），每個樣品做3次重復(fù)。PCR后得到每個陽性對照稀釋樣品的熒光PCR Ct值，并以之為縱軸，以濃度的對數(shù)值為橫軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
探針熒光定量PCR試劑盒原理分析如下圖：

應(yīng)用案例：
樣品 DNA 的制備
1.用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 DNA 提取試劑盒兼 容。。也可以選購本公司的一管式病毒 DNAout 或其升級版柱式病毒 DNAout。 本試劑盒免費(fèi)贈送 15 次 DNA 病毒裂解液試用裝（一管式病毒 DNAout 的成分）。
稀釋陽性對照（以 10E2-10E7 這 6 個 10 倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的長為 86bp 的 DN段作為陽性對照。
2.標(biāo)記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
3.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。
4.在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩 1 分鐘，得1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。5.換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
6.換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
7.換槍頭，在 4 號管中加 5 μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照到 4 號管中，得1×10E4 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用
8.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20  μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）
9.在 PCR 管中加入下列成分。
以下是公司正在銷售的產(chǎn)品：

NIPP1/ARD1  核抑制蛋白酸酶1抗體三糖鐵(TSI)瓊脂

NIPAL3  NIPA樣蛋白3抗體培養(yǎng)基

NIPAL2  NIPAL2蛋白抗體三糖鐵(TSI)瓊脂斜面

NIPA  間變性淋巴瘤激酶核相互作用伴侶蛋白抗體賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基

Ninjurin 2  神經(jīng)損傷誘導(dǎo)蛋白2抗體賴氨酸脫羧酶試驗

Ninjurin 1  神經(jīng)損傷誘導(dǎo)蛋白1抗體氨基酸脫羧酶試驗對照

Ninein/GSK3B interacting protein  GSK3B相互作用蛋白抗體無菌液體石蠟

NIMP/RTN4IP1  NOGO相互作用線粒體蛋白1抗體ONPG 培養(yǎng)基

NIK/MAPKKK14  NFkB誘導(dǎo)激酶抗體營養(yǎng)瓊脂（NA）

NIFK  KI67相互作用蛋白抗體營養(yǎng)瓊脂平板（NA）

Nidogen 2  巢蛋白NID2抗體蛋白胨水（胰蛋白胨培養(yǎng)基）

Nicastrin  老年性癡呆蛋白APH2抗體培養(yǎng)基

NHLRC3  非霍奇金淋巴瘤重復(fù)蛋白3抗體Kovacs 靛基質(zhì)試

NHLRC2  非霍奇金淋巴瘤重復(fù)蛋白2抗體緩沖葡萄糖蛋白胨水

NHLRC1  肌痙攣性癲癇病相關(guān)EPM2蛋白抗體V-P 試豬繁殖與呼吸綜合征病通用型RT-PCR檢測試盒白皮杉醇

蛤弧菌探針法熒光定量PCR檢測試劑盒豬繁殖與呼吸綜合征病（Nsp2 1594~1680變異株）RT-PCR檢測試盒白屈菜紅

豬繁殖與呼吸綜合征病通用型實(shí)時熒光RT-PCR檢測試盒白屈菜

豬繁殖與呼吸綜合征病（Nsp2 1594~1680變異株）實(shí)時熒光RT-PCR檢測試盒白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ

高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（JXA1-R株）實(shí)時熒光RT-PCR檢測試盒白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ

豬繁殖與呼吸綜合征病美洲株實(shí)時熒光RT-PCR檢測試盒白術(shù)內(nèi)酯III

豬繁殖與呼吸綜合征病歐洲株實(shí)時熒光RT-PCR檢測試盒白頭翁素

豬繁殖與呼吸綜合征病美洲型經(jīng)典株與高致病性變異株雙重實(shí)時熒光RT-PCR檢測試盒白頭翁皂苷A

豬繁殖與呼吸綜合征病歐洲株與美洲株雙重實(shí)時熒光RT-PCR檢測試盒白頭翁皂苷B

豬繁殖與呼吸綜合征（類NADC-30株） 實(shí)時熒光RT-PCR檢測試盒白頭翁皂苷B4